一个PhD 的日常挑战：怎样找一个适合的细胞分选方法！
猜想大家可能都有过这种经历，导师要求你在实验室建立一个新的实验方法。
上个月的时候，我导师和我说，想找一个细胞分选的好方法，从人的全血里做CD4 + T 细胞的基因功能研究。
看起来还挺简单的，但搜了一下发现，市面上细胞分选的方法实在太多了……
所以到底哪个合适呢?
在看了几个小时的paper后，我了解到，分选主要是根据所需细胞的属性。对免疫细胞的划分则是依据表面标志CD分子。我组的研究，主要就针对CD4 + T细胞这一特定类群，表面含有CD45、CD3和CD4标记。而表达CD4就是辅助性T细胞的特征。
最普遍的方法就是用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后，再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法，还是要看下游的研究。由于我是想在选出的CD4 + T细胞上做基因功能研究，因此不能采用会影响靶细胞基因表达或者会激活细胞的方法，还得获得大量高纯度、高活力的细胞。
阴选是做基因研究广为推荐的一种方法，间接的获得目的细胞。通常目的细胞上没有筛选标记。通过使用与所有非目的细胞结合的抗体混合物，将非目的细胞从样品中去除，就留下目的细胞了。用磁分离器将无关细胞去除的这个方法其实不是很有效，因为一些没与抗体结合的细胞会被结合的细胞一起连带着选出去。因此，为了提高纯度，分选步骤得重复好几遍。所以阴选我暂不考虑，因为我最终要的细胞需要很纯且不能受分选影响…
因为细胞表面上有CD4标记，也许可以阳选。阳选是直接将目的细胞特异性分选出来，并且几乎不含非目的细胞。通常使用特定的抗体与磁珠偶联，结合目的细胞。而在这种情况下，高亲和力抗体被标记在细胞上，会对许多下游研究产生影响。有时，结合在细胞上的抗体和磁珠可以被二抗的加入而移除。或者，结合物有的时候会自然而然的分离。但大部分情况下，磁珠被保留在目的细胞上，可能会对细胞造成机械压力。
能不能有一个方法把阴选和阳选的优势都结合起来啊…
后来在看到这篇paper 时，Mohr et al. (2018)， 提到了一个叫「Fab-TACS」的技术，作者直接从全血中通过免疫亲和层析来纯化淋巴细胞，新颖又高效。
这个方法是来自德国的一家叫IBA Lifesciences 的公司，他们针对细胞分选有多种kits，而且包含我要做的CD4 + T 细胞。这个会不会就是我要找的呢？
查了一下，Fab-TACS技术是指Fab-based Traceless Affinity Cell Selection，亲和无痕细胞分选。在IBA独家的Twin-Strep-tag®/ Strep-Tactin®基础上，运用免疫亲和层析的原理，利用细胞表面抗原分子CD marker中的Fab片段，捕捉及释放目标细胞。能次次精准的从全血、小鼠脾脏和单细胞组织悬液中选出不带标签，未经激活的细胞。
原理也很便于理解。Fab-TACS柱子填充有经Strep-Tactin®包被的细胞级琼脂糖基质，能与含有Twin-Strep-tag的Fab片段结合。
接着，将全血或是血液样本加入柱子，目的细胞就可以与Fab 片段结合了。非目的细胞被洗掉。
最后，加入生物素（biotin），因为biotin亲和力较高，会中断Fab片段与Strep-Tactin®的结合，此时Fab片段也同时脱离下来。Fab片段因亲和力的降低，自发脱离细胞表面，无标记的目的细胞就到手啦！
4步操作，就可以直接从全血中分离细胞，这确实是非常简单了。而且不涉及到磁珠的使用，也不用制备PBMC，因此实际上其实是可以省下很多时间的！当然，他们公司也提供有能进行自动分细胞分选的设备FABian®。
Fab-TACS技术属于阳选，可以得到非常纯的CD4 +细胞，选出的细胞没有标记，细胞表面无高亲和力抗体或者磁珠。可以将帮助我进行基因研究而而且不影响CD4 +细胞的基因表达。
查了一下这个德国的IBA厂家后，发现他们在中国的代理商是达科为，咨询后我了解到，如果想进行测试，可以尝试一种Fab-TACS Gravity introductory kit，就是我们通常说的入门kit， 而且现在正好有5折的活动 ！！这种性价比高的kit一直是实验室采购的首选啊。于是我就直接订了一个human CD4 + Fab标记的Fab-TACSGravity introductory kit。
收到kit 后，我迫不及待开始了我的CD4 + 细胞分选。像之前了解的一样，不用事先制备PBMC！另外操作步骤也像描述的那样简单，得到的数据如下：
01 高得率
分选后，我的CD4细胞得率为99%，Fab-TACS厉害呀，这真是非常高了。
02 高纯度为了测定细胞纯度，我用CD3-APC / CD4-FITC 将细胞染色，上流式。死细胞以DAPI 染色先行排除，并使用不同FSC / SSC 信号来排除双粘体和细胞碎片。结果显示CD4 细胞的纯度很高，仅有少量红细胞污染！
03 高活力细胞的活力对于下游研究，尤其是那些长期的实验是很重要的。Fab-TACS的可逆性可以确保细胞的高活力和免疫活性，在我的测试中，细胞活率达到了99.6%。
拿着这些数据去找我的导师，他可以说是相当的满意了！完全没想到我能找到一个高效新颖，且性价比贼高的方法～所以po出这篇经验来，也许可以帮助到在苦苦找方法，或者是同做细胞分选的实验汪们。
文章来源：IBA 图片来源：IBA、站酷海洛 题图来源：站酷海洛 Image by Belova59 from Pixabay
话题： CD4, Fab-TACS, T细胞, 基因研究, 细胞分选, 阴选, 阳选
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